برای تعیین غلظت H₂O₂، ۰/۲ گرم از بافت برگی با ۳ میلی­لیتر تری­کلرواستیک­اسید (TCA) 1/0 درصد در یک هاون چینی و محیط یخ سائیده شد. سپس عصاره با دور ۳۵۰۰ دور در دقیقه (rpm) به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ گردید. ۱ میلی­لیتر از مایع رویی به ۱ میلی­لیتر بافر فسفات (۷pH=) و ۲ میلی­لیتر یدید پتاسیم یک مولار اضافه و سپس جذب مخلوط در طول موج ۳۹۰ نانومتر قرائت و مقدار H2O₂ با بهره گرفتن از ضریب خاموشی ۲۸/۰ میکرومتر در سانتی متر محاسبه و بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر بیان گردید (Velikova et al., 2000).

۳-۴-۹- تعیین میزان آب نسبی برگ (RWC)
برای این آزمایش، از قسمت­ های انتهایی ساقه چندین برگ کاملاً توسعه­یافته جدا و سپس دیسک­هایی به قطر ۸ میلی­متر از قسمت میانی پهنک برگ تهیه شد (از هر واحد آزمایشی ۱۰ دیسک برگی)، سپس دیسک­ها به کمک ترازوی دیجیتالی (با دقت ۰۱/۰ گرم) توزین و به پتری­دیش حاوی آب مقطر به مدت ۳ ساعت در یخچال (۴ درجه سانتی گراد) منتقل گردید. پس از خارج کردن دیسک­ها از آب مقطر جهت حذف رطوبت اضافی سطح دیسک­ها، آنها را روی کاغذ صافی قرار داده و سپس وزن آماس آنها اندازه ­گیری شد. پس از تعیین وزن آماس، دیسک­های برگی به آون (۷۰ درجه سانتی گراد) منتقل و پس از گذشت ۴۸ ساعت وزن خشک آنها تعیین و در نهایت RWC با بهره گرفتن از رابطه ذیل محاسبه شد ((Turner,1981.
میزان آب نسبی برگ = [[(وزن خشک – وزن آماس) / وزن خشک –وزن تر) ×۱۰۰
۳-۴-۱۰- تعیین فنول کل گل
برای تعیین فنول کل، ۱ گرم از گل­های کاملا باز شده توزین و با ۶ میلی­لیتر اتانول خالص مخلوط و هموژنیزه گردیدند. محلول به دست آمده با دستگاه سانتریفیوژ و با دور g×۱۲۰۰۰ به مدت ۱۲ دقیقه سانتریفیوژگردید. سپس ۵۰ میکرولیتر از محلول شناور جدا نموده و با ۵۵۵ میکرولیتر آب مقطر و ۱۰۰ میکرولیتر (V:V / 1:1) معرف فولین­سیکالتو رقیق شد. بعد از سپری شدن ۵ دقیقه در دمای اتاق، ۷۵۰ میکرولیتر از محلول سود نرمال، حاوی ۲۰ گرم در لیتر کربنات سدیم، به هر نمونه اضافه و سپس محلولها به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند. در نهایت میزان جذب نمونه­ها در طول موج ۷۶۰ نانومتر قرائت گردیدند (Lemomoine et al., 2007).
* تمام ترکیبات (۴ میلی لیتر محلول کربنات سدیم + ۵ میلی لیتر فولین + ۵/۰ میلی­لیتر حلال عصاره) به غیر از عصاره، بلانک را تشکیل می دهد (به جای عصاره از ۵/۰ میلی لیتر حلال استفاده شد).
* منحنی استاندارد فنول با غلظت های ۲۵۰ و ۲۰۰ ،۱۵۰ ،۱۰۰ ،۵۰ ،۰ (میلی­گرم بر لیتر) از فنول تهیه گردید (شکل ۳-۶). از همبستگی بین غلظت های بکار برده شده فنول (میلی­گرم بر لیتر) با جذب­های خوانده شده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر برای محاسبه فنول کل عصاره استفاده و بر حسب میلی­گرم بر گرم محاسبه گردید.
شکل ۳-۴: منحنی استاندارد فنول کل
۳-۴-۱۱- تعیین مقدار اسانس کل
برای اندازه ­گیری درصد اسانس از روش تقطیر با آب استفاده می­ شود. جهت استخراج اسانس از گل­های گیاه استفاده می­ شود. بنابراین پس از جمع­آوری و آماده ­سازی، گل­های گیاه داخل محفظه مخصوص گیاه در دستگاه کلونجر قرار داده شد. بدین وسیله اسانس همراه با بخار آب در قسمت سرد کننده جمع، اندازه ­گیری و برحسب درصد بیان می شود.
۳-۴-۱۳- سنجش ترکیبات اسانس
برای شناسایی ترکیبات، اسانس ­های مورد نظر پس از آماده ­سازی به دستگاه GC/MSتزریق شدند تا نوع ترکیبهای تشکیل­دهنده آنها مشخص شود. دستگاه گاز کروماتوگرافی استفاده شده از نوع Agilent 6890 با ستون به طول ۳۰ متر، قطر داخلی ۲۵/۰ میلیمتر و ضخامت لایه ۲۵/۰میکرومتر از نوع HP-5MS بودet al., 2005) (Young-Cheol.
۳-۵- تجزیه و تحلیل آماری داده ­ها
برای انجام تجزیه واریانس و مقایسه میانگین­های صفات اندازه ­گیری شده از نرم افزار SAS نسخه ۱/۹ استفاده شد. مقایسه میانگین­ها با بهره گرفتن از آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطوح احتمال ۱ و ۵ درصد انجام گرفت. همچنین برای رسم نمودار از نرم افزار Excel استفاده گردید.
فصل چهارم
نتایج و بحث
۴- بررسی تاثیر غلظت ازت و نسبت نیترات به آمونیوم بر پارامترهای مورفولوژیکی گیاه همیشه بهار
۴-۱- تعداد گل در بوته
با توجه به جدول تجزیه واریانس (جدول۴-۱) مشاهده می­ شود که غلظت ازت بر تعداد گل در بوته در سطح احتمال ۱% معنی­دار شد. همچنین نتایج تجزیه واریانس بیانگر تاثیر معنی­دار برهمکنش غلظت ازت و نسبت نیترات به آمونیوم در سطح احتمال ۱% بر این صفت بود (جدول۴-۱).
جدول۴-۱: نتایج تجزیه واریانس تأثیر غلظت ازت، نسبت نیترات به آمونیوم و اثرات متقابل بر تعداد گل همیشه بهار