۱) درون ماهیچه ای (i.m=Intra muscular)
۲) درون رگی (i.v = Intra venous)
۳) درون پوستی (i.d = Intra dermal)
۴) درون صفاقی (i.p = Intra peritoneal)
۵) زیر پوستی (s.c = Sub cutaneous)
ایمن سازی درون پوستی یک روش مؤثر در ایجاد پاسخ اولیه است. روش های i.m و i.d و یا s.c بهتر است در چندین محل مختلف صورت گیرند.
در مورد خرگوشها، در اولین ایمن سازی به μg200-50 پروتئین در FCA نیاز است که باید به صورت درون پوستی به ۸-۶ جای مختلف از پشت حیوان تزریق گردد. تزریقهای بعدی با فاصله ۲۸ روز یا بیشتر، با ۲۰۰-۵۰ میکروگرم پروتئین آماده شده در PBS یا FIA به فرم i.m یا i.v یا s.c صورت می گیرد (Johnstone, 1996).
۱) اولین تزریق:

• • براساس غلظت نمونه پروتئینی مورد نظر (پروتئین GCSF نوترکیب موجود در بازار دارویی (ساخت شرکت پویش دارو)، ml85 از ویال (۲۰۰ میکروگرم) را برداشته و با ml415 از PBS استریل مخلوط کرده و آن را با μl500 ادجوان کامل فروند مخلوط کرده و با emulsifier آنقدر این دو ماده را مخلوط کردیم تا شیری رنگ و سفت شد.

• • قبل از اولین تزریق،ml 1 خون از حیوان گرفته شد تا به عنوان کنترل منفی (قبل از تزریق) از آن استفاده شود.

• • این نمونه در rpm1500 به مدت ۵ دقیقه سانتریفوژ گردید و سرم از گلبول های قرمز جدا گردید. سرم را در تیوب جدید ریخته و در ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداشتیم.

• • محلول آماده شده از آنتی ژن در FCA به ۸ جای مختلف از پشت خرگوش به صورت درون پوستی تزریق گردید.

۲) دومین تزریق:

• • سی روز پس از اولین تزریق، دومین تزریق به خرگوش باμl 85 از نمونه پروتئینی (۲۰۰ میکروگرم) در μl415 PBS استریل با μl 500 ادجوان ناقص فروند مجدداً به صورت درون پوستی صورت گرفت.

• • ۳۰ روز بعد، ml1 خون از حیوان گرفته شد تا از نظر ایمنی زایی تزریقهای فوق با روش ایمونوبلاتینگ، مورد بررسی قرار بگیرد.

۲-۷-۸ ایمونوبلاتینگ
برای شناسایی پروتئین های اختصاصی از طریق آنتی بادی های پلی کلونال یا مونو کلونال، از لکه گذاری ایمنی استفاده می شود. در روش لکه گذاری ایمنی نمونه های پروتئینی در حضور ماده SDS و عوامل احیاء کننده (مانند ۲- مرکاپتواتانول) الکتروفورز شده و سپس از روی ژل به غشاء نیتروسلولزی یا نایلونی منتقل می گردند و با بهره گرفتن از آنتی بادی های نشاندار شده شناسایی می شوند. برای انتقال پروتئین ها از ژل به غشاء از روش هایی مانند روش تانک و یا روش نیمه خشک استفاده می شود. در روش انتقال با تانک، از بافر حاوی تریس -گلایسین و متانول استفاده می شود که متانول علاوه بر اینکه از تورم ژل جلوگیری می کند، باعث جدا شدن SDS از پروتئین ها شده و بازده اتصال پروتئین به غشاء را افزایش می دهد. در روش انتقال نیمه خشک، ساندویچ انتقال پس از خیس شدن در بافر انتقال، بین دو الکترود بزرگ گرانیتی قرار گرفته و عمل انتقال انجام می گیرد (Sambrook, 2001).

در اینجا روش انتقال با روش نیمه خشک توضیح داده می شود.
مواد لازم
- غشاء نیتروسلولز با منافذ ۴۵/۰ میکرومتری
- کاغذ واتمن
- بافر انتقال (شامل تریس بازی، گلایسین، متانول و آب مقطر می باشد، پیوست ۸).
- دستگاه Semidry
- رنگ پانسوS
روش انجام کار

• • نمونه پروتئینی در مجاورت مارکر پروتئینی با روش SDS-PAGE، الکتروفورز شد.

• • به مدت ۳۰ دقیقه ژل در بافر انتقال قرار داده شد تا از تغییر حجم ژل در هنگام انتقال جلوگیری شود.

• • غشای نیترو سلولزی را به اندازه ژل برش زده و در بافر انتقال قرار می دهیم.

• • چندین لایه کاغذ واتمن (هم اندازه با ژل) را در ظرف حاوی بافر انتقال، مرطوب کرده و سپس کاغذ ها روی صفحه گرانیتی دستگاه بلاتینگ با سیستم نیمه خشک گذاشته شد ( با غلتاندن یک میله شیشه ای حباب های احتمالی بین کاغذها خارج گردید).

• • غشای نیترو سلولز خیس شده به آرامی به گونه ای که حبابی تشکیل نگردد بر روی کاغذ های واتمن قرار داده شد. سپس ژل مورد نظر را را به گونه ای که حباب تشکیل نگردد به آرامی روی کاغذ قرار دادیم.

• • مجدداً چند لایه کاغذ واتمن خیس شده در بافر انتقال، روی ژل قرار داده شد و با غلتاندن میله شیشه ای، حباب های احتمالی را خارج نمودیم.

• • درب دستگاه را بسته و دستگاه را به جریان برق متصل نمودیم و با توجه به اندازه پروتئین، ولتاژ ثابت و زمان انتقال دستگاه تنظیم شد.

• • پس از اتمام زمان انتقال، کاغذ نیتروسلولز با رنگ پانسوS رنگ آمیزی شد تا باندهای پروتئینی ظاهر گردند. از طرفی باندهای مارکر پروتئینی نیز علامت گذاری گردیدند. سپس غشاء با آب مقطر شسته شد تا رنگ پانسوS آن از بین برود.

• • غشاء نیتروسلولز به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق بر روی شیکر در بافر بلوکه کننده قرار گرفت. سپس به مدت ۱۶ ساعت در ۴ درجه سانتیگراد قرار داده شد.

نکته: به منظور بلوکه کردن غشاء در نواحی که فاقد پروتئین است می توان از شیر خشک بدون چربی و یا آلبومین سرم گاوی (BSA) محلول در بافر PBS دارای توئین۲۰ استفاده کرد.

• • آنتی بادی اولیه، سرم خرگوشی رقیق شده به نسبت ۱ به ۵۰۰ در PBS بود. این آنتی بادی به مدت ۲ ساعت در دمای اتاق بر روی غشاء بر روی شیکر انکوبه شد.

• • غشاء ۵ بار ۱۰ دقیقه ای در TTBS بر روی شیکر شسته شد.

• • آنتی بادی دوم، Goat anti Rabbit IgG کونژوگه با HRP بود که به نسبت ۱ به ۱۰۰۰ در PBS رقیق شده بود. این آنتی بادی به مدت ۱ ساعت بر روی غشاء بر روی شیکر انکوبه شد.

• • بعد از اتمام زمان انکوباسیون در آنتی بادی ثانویه، کاغذ پنج بار ۱۰ دقیقه ای با PBS حاوی ۰۵/۰% توئین ۲۰ شستشو داده شد.

• • کاغذ به مدت ۱۰ دقیقه با بافر PBS بدون توئین شستشو داده شد.

• کاغذ نیتروسلولز در محلول سوبسترای آنزیم نشاندار (DAB) گذاشته شد تا باندهای مورد نظر نمایان گردند.