امروزه با پیدایش و توسعه تکنیک نشانگرهای مولکولی بر پایه DNA، مطالعه تنوع بر روی گیاهان آسان‌ترشده است. این نشانگرها ابزار قدرتمندی برای تشخیص ژنوتیپ‏ها و تخمین تنوع ژنتیکی آن ها محسوب می‏شوند(مورف^[۱۳] و همکاران،۱۹۹۴ و پاندیان^[۱۴] و همکاران،۲۰۰۰).

۲-۹ انواع نشانگر
نشانگرهای مولکولی در واقع نشانه‌های روی کروموزم‌ها هستند که در هنگام ایجاد یک نقشه ژنتیکی، به عنوان نقاط مرجع برای شناسایی مکان سایر ژن‌های مورد نظر به کار می‌روند. نشانگرهای ژنتیکی را می‌توان هم در سطح مورفولوژیکی و هم در سطح مولکولی یا سلولی به دو گروه عمومی طبقه‌بندی کرد. نشانگرهای مورفولوژیکی، به عنوان اثر متقابل ژن‌ها و محیط در بیرون از موجود زنده قابل تشخیص هستند. از طرف دیگر، نشانگرهای مولکولی در سطح کوچک‌تر از سلول، شناسایی می‌شوند و می‌توان آن‌ ها را در جریان چرخه زندگی یک موجود و قبل از رسیدن به بلوغ سنجید. نشانگرهای مولکولی را باید ضرورا با روش‌های شمیایی اندازه‌گیری کرد. این نشانگر‌ها به دو نوع نشانگرهای پروتئینی و نشانگرهای DNA تقسیم می‌شوند(آکوا، ۱۳۸۹). هر چه تکرارپذیری یک نشانگر کمتر باشد تشخیص تنوع ژنتیکی حقیقی با بهره گرفتن از آن نشانگر کمتر خواهد بود. نشانگرهای مورفولوژیک بدلیل اینکه تحت تأثیر شرایط محیطی قرار می‌گیرد و همچنین به دلیل کم بودن تعداد آنها قادر به بررسی تنوع ژنتیکی حقیقی به طور معنی‌دار نخواهند بود. در مقابل نشانگرهای مولکولی تحت ثأثیر شرایط محیطی قرار نمی‌گیرند و پوشش ژنومی مناسبی را ایجاد می‌کنند. بنابراین این نشانگرها قادرند نقاط چند شکلی را با اطمینان بالاتری در اختیار قرار دهند و به عبارت دیگر تنوع حقیقی بیشتری را نشان خواهند داد(نقوی و قره‌ریاضی، ۱۳۸۸ ).
مورفولوژیکی آیزوزایم‌ها
بیوشیمیایی
نشانگر پروتئین‌ها
RFLP
مولکولی غیر مبتنی برPCR Minisatellite (مبتنی بر هیبریداسیون) RLGS
دی‌ان‌ای RAPD
نشانگر تصادفی DAF
(Arbitrarilyb primed PCR) AP-PCR
مبتنی بر PCR
نشانگر اختصاصی یا نشانمند از توالیISSR
Sequence tagged Sites SSR
AFP
SSCP
S-SAP
AFLP
SNP
SAMPL
شکل۲-۱ انواع نشانگر(نقوی و قره‌ریاضی،۱۳۸۸)
۲-۲-۹ نشانگرهای ریخت‌شناسی^[۱۵]
نشانگرهای ریخت‌شناسی اولین نشانگرهایی بودند که برای ارزیابی تنوع ژنتیکی مورد استفاده قرار گرفتند این نشانگرها در واقع نتیجه جهش‌های قابل رویت در ریخت ظاهری موجود هستند. ودر صورتی می‌توانند به عنوان نشانگر ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرند که بیان آنها در طیف وسیعی از محیط‌های مختلف تکرارپذیر باشد. اگه چه تنوع ریخت‌شانسی به راحتی قابل مشاهده بوده و کمک زیادی به تحقیقات پایه‌ای می‌کند، ولی به دلیل کم بودن تعداد آنها، وابسته بودن آنها به سن و مرحله رشدی گیاه و وابسته بودن آنها به محیط، استفاده از آنها با محدودیت زیادی همراه است. همچنین عواملی نظیر اثرات غالبیت، اپیستازی و پلیوتروپی بروز این تنوع را تحت تاثیر قرار می‌دهند و استفاده از آن را مشکل می‌سازد. به همین خاطر دستیابی به نشانگرهای کاراتر توجه بیشتر محققین را به خود جلب کرده است(نقوی و قره‌ریاضی،۱۳۸۸). امروزه به خوبی مشخص شده است که استفاده از نشانگرهای تکمیلی مانند نشانگرهای مولکولی و سیتوژنتیکی در کنار نشانگرهای ریخت‌شناسی ارزیابی بسیار جامع‌تر و دقیق‌تری از تنوع گیاهی را به دست می‌دهد(کومار و هیروچیکا، ۲۰۰۱).
۲-۲-۹ نشانگرهای مولکولی
نشانگرهای مولکولی از ابزارهای بسیار مهمی برای مدیریت نمونه‌های ژرم‌پلاسم در بانک ژن، ارزیابی روابط خویشاوندی ژنتیکی، انتخاب گیاهان برتر و بررسی شباهت یا تفاوت بین نمونه‌های مختلف می‌باشد، که برای دستیابی به این اهداف از نشانگرهای مولکولی متعددی استفاده می‌شود(پورساربانی و همکاران، ۱۳۸۴). نشانگرهای مولکولی دارای مزایای متعددی است. این مزایا شامل، صرفه جویی در زمان، استفاده از فضایی آزمایشگاه و قابلیت اطمینان بیشتر به نتایج حاصله می‌باشد(چوکان و واربورتون^[۱۶]، ۲۰۰۶). استفاده از اطلاعات مولکولی در مقایسه با خصوصیات مورفولوژیکی برای بررسی روابط فلیوژنی، از چندین مزیت برخوردار است. به عنوان مثال الف) هیچ گونه ارزیابی شخص در تعیین وضعیت صفات دخیل نیست. ب) به دلیل اینکه ساختمان DNA در تمام موجودات زنده از چهار باز نوکلئوتید تشکیل شده است. بنابراین امکان مطالعه مستقیم متنوع‌ترین اشکال حیات وجود دارد. ج) میزان اطلاعات حاصله بسیار زیاده بوده و بدست آوردن این اطلاعات برای گونه‌های مورد نظر در آزمایشگاه، نسبتا ساده است(کومار و هیروچیکا، ۲۰۰۱). نشانگرهای مولکولی به طور فزاینده در تجزیه و تحلیل ژنتیکی گیاه استفاده می‌شود، با توجه به مزایای آشکار خود بر نشانگرهای مورفولوژیک به عنوان مثال چتدشکلی بالا، تعداد باند بیشتر، با ثبات بودن در سرتاسر مراحل رشد گیاه، و حداقل تأثیر محیط بر آنها به عنوان فاکتور موثر برای بررسی تنوع ژنتیکی استفاده می‌شوند(ویجاتان،^[۱۷] ۲۰۰۵). این نشانگرها مبتنی بر PCR بوده و تنها به مقادیر کمی DNA نیاز دارند و سنجش آنها نسبتا سریع است. تکنیک‌های مولکولی امکان بررسی ژنتیکی دقیق و بررسی عوامل محیطی تنوع را امکان پذیر می‌سازد و سبب دقت بیشتر در اندازه‌گیری و ارزیابی تنوع ژنتیکی می‌گردد(رضوی‌زاده و احسان‌پور، ۱۳۹۱). علاوه بر این قدرت تبعیض عالی در میان ژنوتیپ‌های مشابه و توانایی گروه‌بندی، گروه‌های هتروتیک^[۱۸] بر اساس فاصله ژنتیکی دلیلی دیگر برای استفاده از نشانگرهای مولکولی می‌باشد علاوه بر این تکنولوژی نشانگر مولکولی نقش حیاتی در زیست شناسی گیاهی، از جمله انگشت نگاری DNA، نقشه برداری ژنتیکی، روابط فیلوژنتیک و اصلاح مولکولی دارد( بایر^[۱۹]، ۲۰۰۵ و چوکان و واربورتون، ۲۰۰۶). نشانگرهای مولکولی را به دو دسته نشانگرهای پروتئینی و نشانگرهای حاصل از DNA تقسم‌بندی می‌کنند(عبدمیشانی و شاه‌نجات بوشهری،۱۳۸۶).
۲-۹-۲-۱ نشانگرهای پروتئینی
مطالعه اولیه مولکولی با اهدف طبقه‌بندی با بهره گرفتن از نشانگرهای پروتئینی انجام می‌شد. نشانگرهای پروتئینی فرآورده نهایی ژن‌های ساختاری بوده که در واقع بیانگر تنوع موجود در سطح توالی نوکلئوتیدی ژنوم هستند اما از آنجا که محصولات ژن از روی قسمتی از توالی‌های DNA ساخته می‌شوند در برگیرنده همه تغییرات موجود در سطح DNA نیستند و نمی‌توانند نمایند کل‌ ژنوم باشد. یکی از نشانگرهای پروتئینی معمول نشانگرهای آیزوزایمی هستند که چندین دهه است از ‌آنها استفاده می‌شود. آیزوزایم‌های شکل‌های مختلف یک آنزیم‌اند که اغلب تحریک الکتروفورزی متفاوتی دارند که با بسترهای نشاسته‌ای یا پلی‌اکریلامیدی از یکدیگر جدا می‌شوند(چاولا^[۲۰]، ۲۰۰۲).
۲-۹-۲-۲ نشانگرهای مولکولیDNA
تاکنون انواع مختلف نشانگرهای DNA با تفاوت‌های زیاد از نظر تکنیکی و روش تولید، نحوه کابرد، امیتازبندی، تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج به سرعت ابداع و معرفی گردیده‌اند. بدون ترید ابداع و معرفی واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز یا PCR، بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگرهای DNA داشته است(گوپتا و همکاران ۱۹۹۹). نشانگرهای مولکولی DNA را در سه گروه، مبتنی بر دورگ‌گیری، مبتی بر PCR و مبتنی بر توالی‌یابی تقسیم‌بندی کرده‌اند. تکنولوژی‌های متعدد نشانگری مبتنی بر DNA برای شناسایی چندشکلی‌ها و سنجش زیر مجموعه‌ای از مقدار کل DNA ژنومی توسعه یافته است(کومار و هیروچیا، ۲۰۰۱).
۲-۹-۲-۲-۱ نشانگرهای DNA مبتنی بر دورگ‌گیری
در این گروه انگشت‌نگاری الیگونوکئوتیدی،RFLP، RLGS، VNTRS، Minisatellite قرار می‌گیرد.
۲-۹-۲-۲-۲ نشانگرهای مبتنی بر توالی‌یابی
در این گروه نشانگرهایی مانندEST و SNPقرار می‌گیرد.
۲-۹-۲-۲-۳ نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز از زمان شروع، در بسیاری از روش‌های استاندار زیست‌شناسی مولکولی و بیوتکنولوژی انقلاب ایجاد کرده و باعث تولید نشانگرهای مختلفی شده، این نشانگرها که مبتنی بر واکنشPCR^[21] هستند، شامل:ISSR^[22] ، RAPD^[23]، SSR^[24]، ,SNP^[25]،AFLP^[26]، ^[۲۷]RFLP و غیره می‌باشند(بایر و همکاران۲۰۰۵، چوکان و واربرتون، ۲۰۰۶ و نقوی و قره‌ریاضی، ۱۳۸۸).
از نظر کاربردی نشانگرهای بارز برای استفاده در مطالعات تنوع‌ژنتیکی، همسانه‌سازی مکانی و اشباع سریع نقشه‌های ژنتیکی مناسب‌اند و در مقابل، نشانگرهای هم‌بارز جهت تهیه و افزایش دقت نقشه‌های عمومی برای یک گونه، نقشه‌یابی مقایسه‌ای بین گونه‌ها، نقشه‌یابی جایگاه‌های صفات کمی(QTLS)، تهیه نقشه‌های ژنی و مطالعه ژنتیک جمعیت کاربرد بیشتری دارند(وین^[۲۸]،۲۰۰۳). هر کدام از انواع نشانگر‌هایDNA مجموعه‌ای از مزایا و معایب را در وراثت، تکرارپذیری، میزان اطلاعات بدست‌ آمده، میزان پیچیدگی روش و همچنین جنبه‌های اقتصادی از قبیل هزینه و زمان مورد نیاز تا حصول نتیجه‌ نهایی را دارا هستند(روکاسزی و بولیبوک^[۲۹]، ۲۰۰۴). از آن رو لازم است که قبل از کاربرد هر کدام سودمندی و کارایی نشانگر سنجیده و ارزیابی شود(کومار و هیروچیکا، ۲۰۰۱). یک نشانگر مناسب بایستی قابل دسترس بوده و تفسیر نتایج آسانی داشته، از تکرارپذیری بالایی برخوردار بوده و به فراوانی مناسب در ژنوم باشد(وین، ۲۰۰۳).

نشانگر RAPD: در این روش از یک آغازگر به طول تقریبی ۱۰ نوکلئوتید برای مطالعات ژنتیکی استفاده می‌شود. این روش معمولا برای برآورد تنوع ژنتیکی بین اعضاء جمعیت‌ها یا گونه‌های بسیار نزدیک به هم استفاده می‌شود. چندشکلی در RAPD بر این اصل استوار است که اگر جایگاه اتصال و هیبرید شدن یک آغازگر در یک ژنوم، حتی یک نوکلئوتید تفاوت داشته یاشد، این تغییر می‌تواند منجر به حذف یک باند و ایجاد چندشکلی شود باندهای بدست آمده به عنوان صفات مستقل و البته با ارزش یکسان در نظر گرفته می‌شود. چندشکلی باندها را می‌توان در قالب سیستم جفتی نمره‌دهی کرد. تکرارپذیر بودن یا نبودن نکته مهم استفاده از این روش است ولی با این وجود RAPD به طور گسترده برای تفکیک گونه‌های نزدیک به هم استفاده شده است(ویلیلمز و همکاران، ۱۹۹۰).
نشانگر:AFLP این تکنیک یکی از محبوب‌ترین و سودمندترین روش‌های انگشت‌نگاری ژنتیکی است. AFLP نیز یک روش تکثیر تصادفی می‌باشد. و نیازی به داشتن اطلاعات از توالی موجود مورد بررسی ندارد. AFLP تعداد باندهای بیشتری نسبت به RAPD تولید می‌کند. این روش شیوه‌ای مطمئن و قوی می‌باشد که چندان تحت تاثیرمتغیرهای موجود در واکنش PCR قرار ندارد اما در عین حال روشی پرهزینه است. تکنیک AFLP باعث پیشترفت زیادی در انگشت‌نگاری DNA شده است(فارسی و ذوالعلی، ۱۳۸۴).