۰۳/۲

۰۵۲/۰

۴

۰۴۰/۰

۰۲/۲

۰۲۰/۰

۵

۰۷۹/۰

۴۱/۱

۰۵۶/۰

۶

۰۹۳/۰

۶۷/۱

۰۵۶/۰

۴-۲- تخلیص آنزیم لیپاز TTL
۴-۲-۱- بهینه سازی تخلیص نسبی به روش رسوب دهی دمایی
به منظور حذف بیشترین تعداد ممکن از پروتئین­های ناخالصی موجود در عصاره سلولی و در ضمن حفظ بیشترین تعداد ممکن از آنزیم TTL، بازه­های زمانی مختلفی (۳۰، ۴۰، ۵۰، ۶۰، ۷۰، ۸۰ دقیقه) برای انجام فرایند رسوب دهی دمایی مورد بررسی قرار گرفت. سپس میزان حذف پروتئین­های ناخالصی در هر نمونه با بکارگیری روش SDS-PAGE نشان داده شد. میزان کل پروتئین­ها در هر چاهک μg 12 بود. SDS-PAGE مربوط به رسوب دهی دمایی مخلوط پروتئینی، در بازه­های زمانی مختلف (شکل ۴-۲) نشان می­دهد که پس از ۴۰ دقیقه دمادهی در °C 65 بیشترین میزان حذف پروتئین­های ناخالصی اتفاق افتاده است. از آن­جا که آنزیم TTL مربوط به یک آرکئاباکتر ترموفیل می­باشد، بیان این لیپاز در باکتری E. coli این امکان را فراهم می­نماید که با اعمال تیمار حرارتی برخی از پروتئین­های میزبان را حذف نمود. همچنین در بازه­های زمانی طولانی­تر، حذف بیشتری از ناخالصی­ها دیده نمی­ شود. بنابراین برای به حداقل رساندن اثر منفی حرارت­دهی بر ساختار آنزیم TTL، بهینه زمان رسوب دهی دمایی، ۴۰ دقیقه انتخاب شد.

شکل ۴-۲- بهینه سازی مدت زمان تخلیص به روش رسوب دهی دمایی؛
تصویر SDS-PAGE 5/12 %.
۴-۲-۲- تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی Q- سفاروز
آنزیم TTL به کمک ستون کروماتوگرافی تعویض آنیونی Q- سفاروز با تغییر غلظت نمکی به صورت مرحله­ ای، در مرحله M 15/0 نمک سدیم کلرید، جداسازی شد (شکل ۴-۳). تصویر SDS-PAGE مربوطه تخلیص کامل این آنزیم را تأیید نمود (شکل ۴-۴). جدول ۴-۲ مشخصات مخلوط پروتئینی و بازده مراحل مختلف تخلیص آنزیم TTL را نشان می­دهد. در مرحله نهایی تخلیص ۵/۱۶ درصد از میزان اولیه آنزیم باقی مانده است.
شکل ۴-۳- کروماتوگرام ستون Q- سفاروز؛ تخلیص آنزیم TTL.
جدول ۴-۲- مشخصات مراحل تخلیص TTL.

کل محتوای پروتئین
(mg)

واحد آنزیم^[۹۵]
(U)

فعالیت ویژه (U/mg)

بازده
(%)

تخلیص
(مرتبه)

عصاره سلولی

۲۰/۴۵

۶۴۲/۵

۱۲۵/۰

۱۰۰

۲/۳

رسوب­دهی دمایی

۸۳/۱۲

۱۶۶/۵