جهش دریکی از ۷ ژن
۳-۵ روش شناسی تحقیق
بررسی پرونده های بالینی موجود و شناسایی خانواده ها بر اساس معیار زیر:
انتخاب ۱۰۰ خانواده با حداقل ۲ فرد مبتلا و ۱ خواهر یا برادر سالم
انجام آزمایشات بالینی (انواع تست های شنوایی ودیگر بررسی های بالینی) برای تشخیص ناشنوایی غیر سندرمی و همچنین بررسی اودیوگرام برای تمامی مبتلایان الزامی می باشد.
توضیح در مورد هدف از اجرای طرح و اخذ رضایت نامه از بیمارو یا والدین.
نمونه گیری خون از والدین، فرزندان سالم و مبتلایان
استخراج DNA مطابق پروتکل استاندارد (Salting out)
انتخاب حداقل ۳ مارکر پلی مورفیک برای هر لوکوس
پس از انتخاب مارکرها ، پرایمرهای مربوط به آنها نیز از سایت های بیو انفورماتیکی جهت سفارش آماده شد.
تعیین هتروزیگوسیتی برای مارکرها توسط نمونه های نرمال
آنالیز پیوستگی با بهره گرفتن از PCR و الکتروفورز برروی ژل ۱۶-۸% پلی آکریل آمید برای تفکیک بالاتر و سپس رنگ آمیزی با نیترات نقره
انجام آنالیز پیوستگی در هر خانواده برای هفت ژن(SERPINB6, SLITRK6, OTOGL, GJC3, CABP2, GJB4, NESP4) در ارتباط با ناشنوایی اتوزومی مغلوب و سپس انجام توالی یابی جهت شناسایی جهش مورد نظر
جمع آوری داده ها و تجزیه و تحلیل آن ها از طریق برنامه های codon code و gene runner.
Codon code برنامه ای است که نتایج sequencing را با الگو مرجع[۵۲] مقایسه و بررسی می کند. از طریق برنامه gene runner تاثیرات تغییرات نوکلوتیدی را روی توالی اسید آمینه می توان بررسی کرد.
۳-۶ ملاحظات اخلاقی
با توجه به اینکه کلیه طرح های مرکز تحقیقات ژنتیک در کمیته اخلاقی پژوهشی دانشگاه به تصویب رسیده است، این پروژه بر اساس گرفتن فرم رضایت نامه و رعایت کلیه موازین اخلاقی اجرا می گردد. در هنگام مطالعه به فرد مورد آزمایش شرح و توضیح کافی در مورد تحقیق و فوائد نتایج آن داده شد و همچنین در پایان نتایج در زمینه وضعیت ناقلی فرد بصورت کتبی به وی داده و مشاوره جهت غربالگری های بعدی در اعضاء دیگر خانواده به وی ارائه گردید.
۳-۷ مواد و روش ها
۳-۷-۱ استخراج DNA
مواد لازم جهت استخراج DNA به روش نمک اشباع[۵۳] در جدول ۳-۲ خلاصه شده است:
جدول ۳-۲ مواد لازم جهت استخراج DNA به روش نمک اشباع
مواد
نحوه ساخت مواد
کلرید سدیم اشباع
۲/۲۹۲گرم از کلرید سدیم را با آب مقطر به حجم ۱۰۰۰میلی لیتر می رسانیم .
ایزوپروپانول ۱۰۰%
-
اتانول ۷۰% سرد
-
بافر TE
+ Tris – base (10mM)
EDTA(1mM)
