در بررسی دیگر جهت دستیابی به اطمینان بیشتر از نتایج بدست آمده حاصل از دستگاه جذب اتمی یک سری نمونه هم آماده سازی شده و توسط دستگاه(X-ray Fluorescence Analyzer, Bruker, S4)XRF اندازه گیری عناصر از فلور تا اورانیوم انجام شد که به دلیل مقادیر بسیار کم از عناصر مورد نظر در نمونه ها، دستگاه قادر به نمایش آنها نبوده است و برای دستیابی به دقت بیشتر از دستگاه جذب اتمی برای اندازه گیری ها استفاده شد با این حال جهت اندازه گیری فلزات سنگین آرسنیک و جیوه در ساقه، دانه و برگ گیاه نیاز به دستگاه های با دقت بالاتر می باشد.

انجام آزمایشات جهت بررسی کلی فرم کل و مدفوعی

۲-۵-۱- انجام آزمایشات جهت بررسی کلی فرم های موجود در نمونه های خاک وگیاه

یکی از روش های مرسوم و مورد اعتماد برای شمارش باکتری های کلی فرم استفاده از روش تخمیر چندلوله ای یا اصطلاحاً روش حداکثر تعداد احتمالی) MPN^[28] ( است(Greenberg et al., 1985).
نمونه های جمع آوری شده از مزرعه شامل نمونه های خاک و گیاهی(ساقه ، دانه و برگ) جهت انجام این آزمایش داخل کیسه های فریز قرار گرفته و سر آن بسته شده و جهت حمل به آزمایشگاه بر روی یخ نگهداری شدند و تا زمان انجام آزمایشات میکروبی در یخچال آزمایشگاه قرار گرفتند.
نمونه برداری از خاک تا عمق حدود ۱۵ سانتی متری و به صوت تصادفی انجام گرفت. نمونه های گیاهی به دو صورت ضدعفونی شده سطحی( به منظور تخمین تعداد کلی فرمهای جذب شده از آوندها و ریشه گیاه) و ضدعفونی نشده( به منظور تخمین تعداد کل کلی فرمهای موجود در گیاه) مورد آزمایش قرار گرفتند. همچنین برای بررسی دقیقتر و اطمینان از حضور کلی فرم ها در قسمت ساقه گیاه به عنوان کارآمدترین بخش سورگوم شیرین از دو روش دیگر جهت ضدعفونی و آماده سازی نمونه ساقه برای انجام آزمایشات میکروبی استفاده شد.
در یک روش جهت ضدعفونی کردن سطح نمونه های گیاهی، ابتدا نمونه های گیاهی اعم از ساقه، دانه و برگ را شسته تا خاک از آن ها جدا شود و با آب استریل آبکشی می شوند. سپس آنها را به قطعات ۲ الی ۳ سانتی متری بریده می شوندو سطح بافتها را به مدت یک دقیقه در الکل ۷۰% قرار گرفتند، سپس به مدت ۲ دقیقه در هیپوکلریت سدیم و بعد از آن به مدت ۳۰ ثانیه در الکل ۷۰% قرار گرفتند و در نهایت ۴ مرتبه با آب مقطر استریل شستشو داده شدند و با کاغذ خشک کن آب آن گرفته شد پس از آن نمونه ها توسط پنس و چاقو استریل به قطعات کوچکتر بریده شدند و داخل محلول بافر فسفات و بر روی شیکر( جهت استخراج باکتری های کلی فرم) به مدت ۳۰ دقیقه قرار گرفتند (Chanikarn et al., 2005). همچنین بخشی از ساقه ضدعفونیشده را بعد از اینکه با کاغذ خشک کن آبش گرفته شد در پاکت های مخصوص گذاشته و برای دو روز در آون در دمای ۷۰ درجه سانتی گراد قرار داده میشود سپس آزمایش MPN را انجام می دهیم.
در روش دیگر نمونه های گیاهی ساقه را با آب شهری شستشو داده تا خاک آن جدا شود. سطح ساقهها را با الکل ۷۰% مالش داده و روی شعله گرفته تا الکل آن از بین رود. سپس ساقهها را به قطعات ۲ سانتیمتری بریده و مغز ساقه را در آورده و داخل بافر فسفات و بر روی شیکر به مدت ۳۰ دقیقه قرار دادیم (Denise et al., 2001).
در مورد نمونه های گیاهی ضدعفونی نشده، آنها را بلافاصله بعد از درآوردن از کیسه فریزر به قطعات ریز توسط پنس و اسکالپر تقسیم کرده و داخل بافر فسفات قرار داده شد.
در مورد نمونه های خاک، نمونه خاک مربوط به هر تیمار را به طور جداگانه به مدت ۳۰ دقیقه با بافر فسفات بر روی شیکر قرار داده و سپس از عصاره حاصل برای کشت میکروبی و انجام آزمایش MPN استفاده شد.

۲-۵-۲ ساخت محلول بافر فسفات

مایع رقیق کننده بافر فسفات جهت رقیق کردن نمونه ها طبق استاندارد متد تهیه شد که ابتدا با حل کردن ۳۴ گرم KH₂PO₄ در ۵۰۰ میلی لیتر آب مقطر و رساندن pHآن با سود نرمال به ۲/۷، حجم آن را به یک لیتر رسانده و از این محلول استوک ۲/۱ میلی لیتر را با ۵ میلی لیتر محلول ۸/۸۱ گرم در لیتر MgCl.6H₂O مخلوط نموده و حجم با آب مقطر به یک لیتر رسانده شد که محلول نهایی بافر فسفات است (Greenberg et al., 1985).

۲-۵-۳ انجام آزمایش MPN یا روش تخمیر لوله ای

هدف از انجام این آزمون تعیین تعداد (شاخص MPN) توتال کلی فرم و فکال کلی فرم و تعیین میزان آلودگی مدفوعی در نمونه ها میباشد. این آزمون به شیوهی تخمیر چندلولهای انجام میشود و شامل سه مرحله احتمالی، تأییدی و تکمیلی میباشد.

۲-۵-۳-۱ آزمایش احتمالی

در این آزمایش ابتدا ۵ گرم از نمونه(خاک، برگ، دانه و ساقه) را به ۴۵ میلی لیتر مایع رقیق کننده فسفات بافر اضافه کرده و به مدت ۳۰ دقیقه روی شیکر قرار داده، سپس برای انجام آزمون احتمالی، تلقیح نمونه های فوق به محیط کشت لاکتوز برات همراه لوله درهام با روش ۹ لولهای به صورت دهدهی (۱۰ میلی لیتر به لاکتوز برات دوغلظتی، ۱ میلی لیتر و ۱/۰ میلی لیتر به لاکتوز برات یک غلظتی) انجام گرفت کلیه این عملیات باید در شرایط آسپتیک و با دقت انجام شود که از آلودگی های ثانویه مبرا باشد؛ پس از تلقیح نمونه به لولهها در دمای ۲± ۳۵ درجه سانتی گراد به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور قرار داده می شوند. بعد از گذشت مدت مذکور لوله ها را از نظر تولید گاز مورد آزمایش قرار میدهیم . لوله هایی را که در آنها گاز تولید میشود به عنوان مثبت یادداشت میکنیم. برای جلوگیری از اشتباه و اینکه آیا گازها در لوله های درهام تولید شده و یا اینکه حبابهای ریز هوا در آن بوجود آمده می توان با تلنگر زدن به دیواره لوله از نتیجه آزمایش اطمینان حاصل کرد. در صورتیکه همه لوله ها و یا بعضی از آنها منفی یعنی بدون گاز هستند باید دوباره آنها را به مدت ۲۴ ساعت دیگر در انکوباتور قرار داده و پس از سپری شدن مدت مذکور لوله های با گاز را به عنوان مثبت یادداشت نمود .
بنابر این در این آزمایش، پیدایش گاز در زیر لوله های درهام دلیل بر این است که احتمالاً در نمونه کلی فرم وجود دارد و در صورتیکه در هیچ کدام از لوله ها گاز تولید نشود ، دلیل بر منفی بودن آزمایش احتمالی یعنی نبودن کلی فرم ها در نمونه مورد آزمایش می باشد. نتایج این مرحله را بر حسب رقت و تعداد لوله های مثبت بصورت کد سه رقمی یادداشت می کنیم.
برای تخمین کلی فرم ها در ۱۰۰ میلی لیتر نمونه و یا به عبارت دیگر برای تعیین بیشترین تعداد احتمالی (M.P.N) کلی فرمها در ۱۰۰ میلی لیتر نمونه از جداول مشخص شده استفاده میشود . در صورتیکه جدول در اختیار نباشد و یا شمارش بدست آمده با جدول قابل تطبیق نباشد، می توان برای بدست آوردن MPN در ۱۰۰ میلی لیتر از فرمول زیر استفاده کرد :

۲-۵-۳-۲ آزمایش تأییدی

از آنجا که باکتریهای دیگری غیر از کلی فرم ها نیز قادر به تخمیر لاکتوز و تولید گاز هستند، نمیتوان گفت که گاز تولید شده در لوله های درهام در آزمایش احتمالی فقط مربوط به آلودگی کلی فرم هاست ، بنابر این برای بدست آوردن اطمینان بیشتر از نتیجه آزمایش، باید آزمایش تأییدی انجام شود، از آنجایی که در این مرحله علاوه بر کلی فرم ها باکتری های دیگری هم هستند که می توانند نتیجهای مشابه کلی فرم ها بدهند در مرحله بعد لازم است حضور کلی فرم ها در هر یک از این لوله های مثبت تأیید شود. برای این منظور از هر یک از لوله هایی که از نظر حضور کلی فرم مثبت هستند (احتمالاً در آنها کلی فرم رشد کرده) تلقیح از لاکتوز برات به محیط کشت برلیان گرین لاکتوز بایل برات(BGLB) انجام شد.
این محیط طبق دستور کارخانه سازنده آماده و در لوله های آزمایش حاوی لوله دورهام توزیع و استریل میگردد. تمام لوله های آزمایش مرحله احتمالی که پس از ۲۴ یا ۴۸ ساعت گرماگذاری، رشد زیاد، تشکیل هر میزان گاز و یا رشد اسیدی در آنها مشاهده شده است، برای مرحله تأییدی آزمایش میشوند. چنانچه فعالیت تخمیری یا رشد اسیدی زیاد، در لوله های اولیه زودتر از ۲۴ ساعت ظاهر گردید، می توان آنها را پیش از اتمام زمان ۲۴ ساعت به مرحله تأییدی منتقل نمود. لوله های مرحله اول را که تولید گاز و اسید در آنها مشاهده میشود به آرامی چرخانده یا تکان می دهیم تا میکروارگانیزم ها در آن به صورت شناور درآیند. ۱ میلی لیتر از محلول داخل لوله را به لوله تخمیر دوم حاوی محیط BGL broth منتقل میکنیم. لوله های حاوی محیط کشت و نمونه را که در این مرحله آماده شدهاند به مدت ۴۸ ساعت در ۲±۴۲ درجه سانتیگراد در بن ماری قرار داده شدند. در این مرحله فقط تولید گاز ملاک مثبت بودن آزمایش است .سپس کد سه رقمی را بر اساس تعداد لوله های مثبت هر رقت یادداشت می نمائیم.

۲-۵-۳-۳ آزمایش تکمیلی

سومین دسته از آزمایشهای استاندارد MPN کلی فرم ها که برای تشخیص قطعی این باکتری ها لازم است، آزمایش تکمیلی میباشد که پس از آزمایش تأییدی انجام میگیرد.
برای انجام این آزمایش از تمام لوله های مثبت در آزمایش تأییدی، نمونههایی بر روی یک یا چند بشقاب حاوی محیط کشت ENDO یا EMB (ائوزین متیلن بلوآگار) کشت میدهند. سپس محیط کشت داده شده را به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور ۲±۳۵ درجه سانتیگراد قرار میدهند. پس از این مدت کلنی های بدست آمده را مورد مطالعه قرار میدهند.
کلنی هایی که روی محیط کشت ENDO یا EMB رشد کردهاند، به سه دسته مشخص، نامشخص و منفی تقسیم میشوند. کلنی های مشخص دارای مرکز سیاه با جلای فلزی میباشند. کلنی های نامشخص به کلنی هایی گفته میشود که بدون مرکز سیاه ، موکوژی شکل، غیر شفاف و صورتی رنگ هستند و کلنی های منفی به سایر کلنی های با مشخصات دیگر گفته می شود. برای تأیید نهایی، از کلنی های رشد کرده بر روی محیط کشت EMB، اسلاید تهیه نموده و به روش گرم رنگ آمیزی مینمایند. دیدن باسیل های گرم منفی قرمز رنگ بدون اسپور دلیل بر وجود کلی فرمها و مثبت بودن نتیجه آزمایش است.

۲-۵-۴- رنگ‌آمیزی گرم

رنگ‌آمیزی گرم (Gram staining) یکی از مهم‌ترین و متداولترین روش‌های رنگ آمیزی در میکروبیولوژی است که اولین بار توسط کریستین گرم ابداع شد. دراین رنگ آمیزی باکتری‌ها بر مبنای رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می‌شوند. رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول و به عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد. در رنگ آمیزی گرم باکتری‌های گرم مثبت پس ازرنگ آمیزی به رنگ بنفش و باکتری‌های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می‌شود. گرچه هر دو گروه یعنی باکتری‌های گرم مثبت و منفی دارای دیواره می‌باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آنها وجود دارد. اساس ساختمان در دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت یک لایه ضخیمی‌است از پپتیدوگلیکان ولی در باکتری‌های گرم منفی ضخامت آن به حداقل می‌رسد.
از رنگ امیزی گرم به جهت شناسایی جنس باکتری استفاده می شود. با این حال همه باکتری ها را نمی توان با رنگ امیزی گرم مشاهده نمود.
۲-۵-۴-۱- روش رنگ‌آمیزی گرم
پیش از آغاز رنگ آمیزی نخست باید یک فروتی از محیط کشت خالص باکتری بر روی لام تهیه کنیم، در ادامه مراحل رنگ آمیزی گرم به قرار زیر هستند:
نخست رنگ کریستال ویوله رابه مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه برروی فروتی باکتری روی لام می ریزیم، درنتیجه همه باکتری‌ها به رنگ بنفش درخواهد درآمد.
پس از شستشوی فروتی با آب، رنگ کریستال ویوله را با افزودن لوگول به مدّت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه تثبیت میکنیم. لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده و ایجاد کمپلکس‌هایی می کند که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله در داخل دیواره سلولی باکتری می‌شود. پس از این مرحله، همه باکتریها کماکان به رنگ بنفش مشاهده می‌شوند.
مرحله رنگ زدایی:
مهم‌ترین مرحله رنگ آمیزی است. دراین مرحله پس از شستشو لام با آب، لام به مدت ۱۵ تا۲۰ ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می‌گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می‌گیرد. درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه‌های پپتیدو گلیکان محدود و غشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه‌ها و غشا می‌گردد و باکتری رنگ مراحل قبل را از دست می‌دهد ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت ضخامت زیاد لایه پپتیدوگلیکانی و عدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل از غشا خارج نمی‌شود. درنتیجه پس از این مرحله باکتریهای گرم منفی بیرنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند. در انتها سطح فروتی را با سافرانین یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه می‌پوشانیم سپس با آب شستشو داده و پس از خشک شدن با میکروسکوپ مورد بررسی قرار می گیرد.
نتیجه:
دراین مرحله باکتری‌های بی رنگ (باکتریهای گرم منفی) به رنگ قرمز درمی‌آیند و باکتری‌های بنفش (باکتریهای گرم مثبت) بدون تغییر رنگ باقی می‌مانند (Greenberg et al., 1985).
البته لازم به توضیح است که در اغلب آزمایشگاه ها تنها دو مرحله احتمالی و تأییدی انجام می شوند.

فصل سوم

نتایج

۳- ۱- پارامترهای رشد گیاه:
۳- ۱- ۱ بیوماس
تأثیر دو کیفیت آب آبیاری و سطوح مختلف کود اوره روی بیوماس در جدول ۳-۱ ارائه شده است. نتایج نشان داد که بین سطوح عامل فرعی (مصرف ۰، ۱۰۰، ۱۵۰و ۲۰۰ کیلوگرم در هکتار کود اوره) در سطح احتمال ۱% تفاوت معنی داری وجود داشت اما بین سطوح عامل اصلی یعنی کیفیت آب آبیاری (فاضلاب خام و تصفیه شده) و بین اثر متقابل کود و فاضلاب اختلاف معنی داری وجود وجود نداشت.
جدول ۳-۱ تجزیه واریانس بیوماس گیاه