درصد استریفیکاسیون نمونه ها
شکل ۳-۷، نمودار ستونی درصد استری شدن نمونه‌های پروتئینی که به ستون قرمز کوچک BLG پنتیله، زرد
BLG هگزیله، صورتی BLG بوتیله، سبز BLG پروپیله، آبی BLG اتیله و قرمز BLG متیله را نشان می‌دهد.
۳-۴- نتایج آزمون ضدباکتریایی
به دلیل این‌که استری کردن با متانل و اتانول، درصد بیشتری از پروتئین را استری می‌کرد؛ ابتدا با این دو الکل به همراه ایزوپروپانل، آزمون ضدباکتریایی بر روی گونه‌های گرم مثبت باسیلوس سابتیلیس،استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین و گونه‌های گرم منفی ایشیریشیا کلی، سالمونلا تیفی و کلبسیلا انجام پذیرفت که نتایج آن را در شکل‌های ۳-۸ تا ۳-۱۵ آورده شده‌اند.
الف
ب
شکل ۳-۸، تصاویر محیط کشت آزمون ضدباکتریایی الف) ایشیریشیا کلی و ب) باسیلوس سابتیلیس،
که در آن BE=BLG اتیله، BP=BLG پروپیله و BM=BLG متیله می‌باشد. در این آزمون از BLG
خالص (BN) نیز استفاده شده است.
الف
ب
شکل ۳-۹، تصاویر محیط کشت آزمون ضدباکتریایی الف) کلبسیلا و ب) سالمونلا تیفی،
که در آن BE=BLG اتیله، BP=BLG پروپیله و BM=BLG متیله می‌باشد. در این آزمون از BLG
خالص (BN) نیز استفاده شده است.
شکل ۳-۱۰، تصاویر محیط کشت آزمون ضدباکتریایی استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین،
که در آن BE=BLG اتیله، BP=BLG پروپیله و BM=BLG متیله می‌باشد. در این آزمون از BLG
خالص (BN) نیز استفاده شده است.
شکل ۳-۱۱، آزمون ضدباکتریایی اثر BLGپروپیله بر MRSA با کدورت ۵/۰ مک‌فارلند.
همانطور که در تصاویر موجود در شکل‌های ۳-۸، ۳-۹ و ۳-۱۰ مشاهده می‌کنید، هیچ کدام از این سه پروتئین استری شده به غیر از BLG پروپیله دارای اثر مهاری بر روی باکتری‌ها نبودند که این پروتئین هم فقط دارای اثر مهاری بر روی MRSA بود.به همین دلیل جهت مشاهده بهتر هاله ایجاد شده توسط BLG پروپیله در اثر کردن بر روی MRSA، از این باکتری کدورت ۵/۰ مک فارلند تهیه شد تا این اثر بهتر دیده شود که تصویر آن را در شکل ۳-۱۱ مشاهده می‌فرمایید.
به دلیل اینکه ایزوپروپانل الکل سه کربنه است و MRSA هم یک باکتری گرم مثبت، بر آن شدیم تا اثر ضدباکتریایی الکل‌های بیشتری و باکتری‌های گرم متبت بیشتری را مورد مطالعه قرار دهیم.
الف
ب
شکل ۳-۱۲، تصاویر محیط کشت آزمون ضدباکتریایی استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس، الف) BE=BLG اتیله، BM=BLG متیله، BP=BLG پروپیله و BN=BLG خالص. ب) BB=BLG بوتیله، BPn=BLG پنتیله و BH=BLG هگزیله.
الف
ب
ج
شکل ۳-۱۳، آزمون ضدباکتریایی الف) ایشیریشیا کلی (BB=BLG بوتیله، BPn=BLG پنتیله و BH=BLG هگزیله)، ب) کلبسیلا (BB=BLG بوتیله، BPn=BLG پنتیله و BH=BLG هگزیله) و ج) MRSA( BB=BLG بوتیله، BPn=BLG پنتیله، BH=BLG هگزیله و B1-P=BLG n-پروپیله)
الف
ب
شکل ۳-۱۴، تصاویر محیط کشت آزمون ضدباکتریایی باسیلوس سرئوس، الف) BE=BLG اتیله، BM=BLG متیله، BP=BLG پروپیله و BN=BLG خالص. ب) BB=BLG بوتیله، BPn=BLG پنتیله و BH=BLG هگزیله.
شکل ۳-۱۵، تصاویر محیط کشت آزمون ضدباکتریایی MRSA با BLGخالص پروپیله شده.
فصل چهارم
بحث
۴-۱- خالص‌سازی BLG
روش‌های بسیاری برای جداسازی BLG توصیه شده‌اند اما اغلب آن‌ ها عملی نیستند و تنها برای مصارف آزمایشگاهی قابل استفاده‌اند و هنوز ما نیازمند روشی هستیم که بتوان از آن برای حجم‌های بسیار زیاد استفاده کرد تا هزینه تولید این پروتئین کاهش یابد(Konrad et al. 2000). اولین بار در سال ۱۹۳۴، پالمر جداسازی BLG را از شیر، و بلوری کردن آن را گزارش کرد. از آن زمان تا کنون پیشرفت‌های بسیاری در روش‌های خالص سازی صورت گرفته است و تنها زمان‌بر بودن این روش‌ها است که همچنان باقی است.(Fox KK et al. 1967)

روشی که برای خالص‌سازی BLG در نظر گرفته شد (Armstrong et al. 1967)، روشی است که از لحاظ امکانات بسیار ساده ولی بسیار دقیق و با بازده بالا می‌باشد که با توجه به اهداف این طرح تمامی نیازهای ما را پوشش می‌داد. از آن جایی که ما هدفمان دست‌ورزی یک پروتئین کامل بود، میزان خلوصی که این روش برای ما فراهم می‌آورد بسیار کافی بود و سرعت به دست آوردن این پروتئین هم با توجه به این روش بسیار بالا بود. کار با نمک مورد استفاده در این روش بسیار راحت بوده و در صورت دیدن اثر ضدباکتریایی توسط این پروتئین، به راحتی و در کمترین زمان می‌توان مقدار مورد نیاز جهت استری کردن را فراهم نمود.
۴-۲- استری کردن BLG
استری کردن یک روش مهم برای دست‌ورزی پروتئین‌ها است. اساس واکنش به این ترتیب است که استری کردن با الکل‌های مختلف باعث مسدود شدن گروه‌های کربوکسیل می‌شود و بنابراین با خالص مثبت و شاخصه بازی پروتئین را افزایش می‌دهد (Halpin and Richardson 1985).
معمولا به دلیل سهولت تاکنون، بیشتر با الکل‌های کوچکی مانند متانل و اتانل، استری کردن BLG انجام شده بود، اما ما این کار را با الکل‌های بزرگتری نیز انجام دادیم تا اثرات آن‌ ها را هم بررسی کنیم. در کارهای گذشته تلاش برای استری کردن BLG با بهره گرفتن از ایزوپروپانل با شکست مواجه شده بود (Sitohy M, Chobert et al. ۲۰۰۱) که علت آن افزودن مقدار کمی کاتالیزور اسیدی بوده. البته لازم به ذکر است که هر چه الکل بزرگتر می‌شود از درصد استری شدن آن کاسته می‌شود ولی بررسی همان درصد کم استری شده نیز اهمیت بسیار زیادی داشت.
۴-۳- سنجش میزان استری شدن
چندین روش‌ برای سنجش میزان استری شدن توسعه یافته‌اند که از دقت‌های مختلفی برخوردارند(Halpin and Richardson 1985) ولی روش رنگ سنجی به کار رفته در این طرح این امکان را به ما می‌دهد که درصد استری شدن نمونه‌ها را با هم مقایسه کنیم و این امکان را برای ما فراهم می‌کند که نتایج را به صورت درصد بیان کرده و نمونه‌ها را با غلظت‌های مختلف با هم مقایسه کنیم. نتایج حاکی از استری شدن به نسبت مطلوب نمونه‌ها بوده و با افزایش زنجیره هخمانطور که انتظار میرفت، میزان استری شدن کاهش یافته است.
۴-۴- آزمون ضدباکتریایی
پیش از این برخی خواص ضدباکتریایی پپتیدهای BLG بررسی شده بود (Pellegrini, Dettling et al. ۲۰۰۱) و همچنین خواص ضدویروسی نمونه استری شده این پروتئین در برابر ویروس آنفولانزای A زیرگونه ^[۱۸۸]H3N2 (Sitohy Mahmoud, Besse et al. ۲۰۱۰) و هرپس سیمپلکس^[۱۸۹] ویروس نوع ۱ (Sitohy Mahmoud, Billaudel et al. ۲۰۰۷) مطالعه گردیده بود. همچنین خواص ضد ویروسی چندین پروتئین شیر نیز بررسی شده بود (Waarts, Aneke et al. ۲۰۰۵).ولی تا کنون اثر ضدباکتریایی BLG دست‌ورزی شده و به صورت کامل بررسی نشده بود، به همین دلیل تصمیم گرفتیم تا اثر این پروتئین را به صورت کامل و استری شده تحت آزمون قرار دهیم که مراحل زیر را پیمودیم.
آزمون ضدباکتریایی توسط پروتئین‌های استری شده برای باکتری‌های مختلفی انجام شد. در ابتدا به این دلیل که تصور می‌شد پروتئین استری شده می‌تواند دارای اثرات مختلفی بر گونه‌های گرم مثبت و گرم منفی باشد، در مرحله اول باکتری‌های گرم مثبت باسیلوس سابتیلیس(شکل ۳-۸) و MRSA و باکتری‌های گرم منفی ایشیریشیا کلی، سالمونلا تیفی و کلبسیلا(شکل۳-۸ و شکل۳-۹) توسط BLG استری شده با متانل و اتانول و ایزوپروپانل تحت این آزمایش قرار گرفتند. طبق نتایج نشان داده شده ملاحظه می‌شود که تنها BLG پروپیله دارای اثر ضدباکتریایی بر روی MRSA (شکل۳-۱۰) بود.
دیدن این نتیجه باعث شد تا در ابتدا تصور کنیم که با افزایش تعداد کربن‌های الکل و افزایش آب گریزی آن بر اثر ضدباکتریایی پروتئین استری شده آن افزوده می‌شود. بنابراین بر آن شدیم تا BLG را با الکل‌های بزرگتری استری کنیم و همچنین روی دیگر گونه‌های استافیلوکوکوس اورئوس اثر آن را بررسی کنیم. برای انجام این مهم BLG را با بوتانل، پنتانل و هگزانل هم استری کردیم و اثر آن‌ ها را بر روی MRSA، ایشیریشیا کلی، کلبسیلا، باسیلوس سرئوس، باسیلوس سابتیلیس(شکل ۳-۱۳) و استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس(شکل ۳-۱۲) بررسی کردیم و همچنین اثر BLG متیله، اتیله و ایزوپروپیله را بر باکتری‌های جدید باسیلوس سرئوس(۳-۱۴) و استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس نیز مشاهده کردیم.
نتایج حاصل از این آزمون‌ها نشان داد که BLG بوتیله، پنتیله و هگزیله دارای اثر ضدباکتریایی بر هیچ کدام از باکتری‌ها نبوده و BLG متیله