ریزنمونه‌های مختلف مانند ریز‌نمونه‌های برگ، بساک، میوه نارس، میوه بالغ و آندوسپرم مورد بررسی قرار گرفت. در این تحقیق از ژنوتیپ‌های مختلف ارقام بومی خرما از جمله استعمران و خضراوی موجود در کلکسیون نخل دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان استفاده شد.
۴-۳ محیط کشت
۱-۴-۳ تهیه محیط کشت
تهیه یک لیتر محیط کشت به ترتیب زیر انجام گرفت: پس از ریختن ۳۰۰-۲۰۰ میلی‌ لیتر آب مقطر در یک ارلن یک لیتری، محلول‌های عناصر میکرو و ماکرو و ویتامین‌ها از استوک‌های تهیه شده طبق پیوست ۱ به ارلن اضافه شدند. اگر در تهیه محیط کشت نیاز به اضافه کردن تنظیم‌کننده‌های رشد باشد، در این مرحله اضافه می‌شوند. محیط کشت به‌دست آمده با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانیده شد. پس از اضافه کردن مقادیر لازم ساکارز و زغال فعال به ترکیبات قبلی و حل شدن کلیه مواد با همزن مغناطیسی،pH محیط کشت پس از شستشوی الکترود دستگاه pH متر با آب مقطر و خشک کردن با دستمال کاغذی با چند قطره هیدروکسید سدیم ۱ یا ۱/۰ مولار یا چند قطره اسید‌کلریدریک ۱ یا ۱/۰ pH تنظیم شد. در مرحله آخر ۸ گرم آگار به محیط کشت اضافه گردید. محیط‌های تهیه شده در اتوکلاو با دمای ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد و فشار ۱۵ پاسکال (PSI) به مدت ۱۵ دقیقه استریل شدند.
۲-۴-۳ تهیه استوک هورمون‌ها
مقدار ۵۰ میلی‌گرم از هر یک از هورمون‌های مورد نظر وزن و در یک بشر ۵۰ سی‌سی استریل با چند قطره سود ۱/۰ نرمال برای سیتوکینن یا اتانول برای اکسین ۹۶ درصد حل و سپس با آب مقطر حجم آن به ۵۰ سی‌سی رسانیده شد و به این ترتیب استوک ۱:۱ تهیه شد. در نهایت میزان مورد نیاز هر تیمار محاسبه و به محیط کشت اضافه گردید. پس از استفاده استوک‌ها در یخچال نگه‌داری گردیدند.

۵-۳ آزمایشات انجام شده
۱-۵-۳ آزمایش اول: بررسی تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد ۲,۴-D، TDZ و BAP بر جنین‌زایی سوماتیکی از ریز نمونه برگ خرما
بدین منظور آزمایش در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی (CRD) با سه تکرار انجام شد.
برای تهیه ریزنمونه، از برگ‌های سبز در حال رشد در مرکز پاجوش استفاده و از ساقه‌چه جدا گردیدند (تصویر ۱-۳ الف). سپس ۱ سانتی‌متر از ابتدا و انتهای برگچه‌ها برش داده شد و به اندازه ۱ تا ۲ سانتی‌متر قطعه قطعه شدند (تصویر ۱-۳ ب). قبل از استریل کردن ریز نمونه‌ها، با آب جاری با چند قطره مایع شوینده به مدت ۳۰ دقیقه شستشو شدند و سپس با الکل اتانول ۷۰% درصد اسپری شدند و به زیر هود لامینار انتقال یافتند. برای استریل کردن ریزنمونه ها قطعات برگی در هیپو‌کلرید‍‍‌سدیم ۲۵/۵ به مدت ۱۰ دقیقه قرار داده شدند و پس از آن ۳ بار با آب مقطر اتوکلاو شده به مدت ۱۰ دقیقه شستشو داده شدند. سپس برای حذف سلول‌های مرده مجدداً ابتدا و انتهای هر قطعه با تیغ اسکالپل^[۲۷۷] برش داده شد و در محیط کشت‌های تهیه شده کاشته شد (تصویر ۱-۳ ج). برگچه‌های نخل از محل رگبرگ میانی خود تا می‌خورند، که قبل از کشت باز شد. ریزنمونه‌ها به صورت افقی و همه از یک سمت پشت برگچه کشت گردیدند. در هر تکرار ۲-۳ ریزنمونه کشت شد و درب شیشه‌های کشت شده با پارافیلم^[۲۷۸] مسدود شد تا احتمال آلودگی کاهش یابد. مشخصات هر کشت شامل: ‌نوع ریزنمونه، تاریخ کشت و نوع محیط کشت روی شیشه‌ها ثبت شد و کشت‌ها به اتاق رشد و تاریکی مطلق منتقل شدند.
جهت تهیه محیط کشت، ابتدا ۲۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر در داخل یک بشر ۲ لیتری ریخته شد. مقادیر لازم برای ۲ لیتر از محلول‌های ذخیره‌ای توسط پیپت مدرج به بشر اضافه گردید، ساکارز به میزان۴۰ گرم در لیتر توزین و به بشر افزوده شد. محلول بر روی هات‌ پلیت هم‌زده شد تا محلول کاملاً یکنواخت به دست آمد. حجم محلول به حجم نهایی ۲۰۰۰ میلی‌لیتر رسانده شد. و محلول بین ۲۰ فلاسک ۱۰۰ میلی ‌لیتر در هر فلاسک توزیع ‌گردید. تنظیم‌کننده‌های رشدی ۲,۴-D و BAP بر اساس جدول ۱-۳ به فلاسک‌ها افزوده شد. زغال فعال به میزان ۱ گرم در لیتر اضافه شد. pH محلول‌ها با بهره گرفتن از هیدروکسید‌سدیم و اسید هیدروکلریک در حدود ۷/۵ تنظیم گردید. آگار به میزان ۸ گرم در لیتر هر کدام از فلاسک‌ها اضافه گردید. فلاسک‌ها درون اتوکلاو به مدت ۲۰ دقیقه و دمای C˚۱۲۱ سترون شدند. در محیط کشت اولیه به منظور خروج ترکیبات فنولیک آنتی‌اکسیدانت‌های آسکوربیک اسید و سیتریک اسید به محیط کشت به نسبت ۷۵:۷۵ میلی‌گرم در لیتر (خان و بی‌بی، ۲۰۱۲) استفاده شد. از آنجایی که TDZ و آنتی اکسیدانت نسبت به حرارت حساس هستند پس از اتوکلاو بر اساس جدول ۱-۳ به بشر‌ها افزوده شد. محتوای هر فلاسک در زیر هود لامینار بین سه پتری توزیع شد.
جدول۱-۳ ترکیبات تنظیم‌کننده‌های رشد در محیط کشت در آزمایشات اول، سوم، چهارم و هشتم (میلی‌گرم در لیتر)