فصل سوم
روش­شناسی پژوهش
۳-۱- مقدمه
در فصل گذشته خلاصه­ای از کل طرح پژوهشی با توجه ویژه بر اهداف و مبانی پژوهش به تفصیل بیان و پس از آن، مطالعات انجام گرفته در این زمینه بررسی شدند.
در فصل حاضر، اطلاعات کلی درباره روش­های اجرای پژوهش، متغیر­های پژوهش، جامعه آماری و نحوه کار با نمونه­های آماری، چگونگی سنجش متغیر­ها و ابزارهای مورد استفاده در پژوهش ارائه خواهد شد. در نهایت، نحوه تجزیه و تحلیل داده ­ها و روش­های آماری مورد استفاده بیان می­شوند.
۲-۳- روش و طرح پژوهش
این پژوهش از نوع تجربی و آزمایشگاهی و با مدل حیوانی است. در این پژوهش تغییرات حاصل از اجرای یک دوره تمرین اکسنتریک دویدن در سراشیبی در گروه تمرینی اکسنتریک (۸ = n) و همچنین یک دوره تمرین تناوبی سرعتی در گروه تمرینی تناوبی (۸ = n) به همراه یک گروه کنترل (۸ = n) از موش­های صحرایی بر بیان ژن­های FOXO1 و MHC-I، MHC-IIa، MHC-IIX و MHC-IIb، پس از گذشت ۹ هفته تمرین مورد بررسی قرار داده شده است.
۳-۳- متغیر­های پژوهش
۳-۳-۱- متغیر­های مستقل
۹ هفته تمرین اکسنتریک دویدن در سراشیبی
۹ هفته تمرین تناوبی سرعتی SIT
۳-۳-۲- متغیر­های وابسته
بیان ژن FOXO1
بیان ژن MHC I
بیان ژن MHC IIa
بیان ژن MHC IIx
بیان ژن MHC IIb
۳-۳-۳- متغیر­های مداخله­گر قابل کنترل
شرایط فیزیکی آزمودنیها: تمامی آزمودنیها­ی حیوانی از موسسه تحقیقات واکسن و سرم­سازی رازی و تحت شرایط جسمی سالم تحویل گرفته شدند.
شرایط محل نگهداری حیوانات: تمامی آزمودنیها در شرایط مطلوب و یکسان از نظر دما، رطوبت، تهویه و چرخه نور و روشنایی نگهداری شدند.
تغذیه: تمامی آزمودنیها از یک ماده خوراکی یکسان به صورت پلت استفاده کردند. این ماده غذایی در کل مدت پژوهش از یک منبع یکسان خریداری شد.
سن و وزن: آزمودنیها علاوه بر یکسان سازی از نظر سنی، در روز آغاز پروتکل فعالیت ورزشی از نظر وزن در دامنه مطلوبی نیز یکسان­سازی شدند.
۳-۴- جامعه و نمونه­های پژوهش
جامعه آماری این پژوهش را موش­های صحرایی نژاد اسپراگ داولی موسسه تحقیقات واکسن و سرم­سازی رازی تشکیل دادند. ۲۴ سر موش ۴ هفته­ای (دامنه وزنی ۱۸۰ تا ۲۲۰ گرم) که پس از یک هفته که برای آشنا­سازی با محیط در آزمایشگاه حیوانات دانشکده تربیت بدنی و علوم ورزشی دانشگاه خوارزمی نگهداری می­شدند به ۳ گروه ۸ تایی تقسیم شدند. لازم به ذکر است که این تقسیم بندی از لحاظ وزنی یکسان سازی شد.

۳-۵- اخلاق کار با حیوانات آزمایشگاهی^[۴۷]
کار با موش­های صحرایی در پژوهش حاضر از ضوابط اخلاقی نگهداری و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی کشور استرالیا استفاده شد. به طور خلاصه در تمامی مراحل کار پژوهشگر با اعتقاد بر اینکه مسئول حفظ آسایش حیوانات است همواره این ۳ اصل را رعایت کرد:
تا حد امکان بنا­بر اهداف پژوهش حیوانات آزمایشگاهی را جایگزین کند^[۴۸].
از حداقل تعداد ممکن حیوانات برای رسیدن به اهداف پژوهشی استفاده کند^[۴۹].
همواره بهبود شرایط زیستی حیوانات با توجه به خصوصیات گونه آن­ها مد نظر قرار گرفته شود^[۵۰].
با توجه به این اصول، پروژه طوری طراحی شد که حیوانات با حداقل درد و استرس نامطلوب مواجه شوند. در این ارتباط، توجه به نشانه­ های درد و استرس در تمامی مراحل راهنمای پژوهشگر بود. پژوهشگر از تمام روش­های موجود استفاده کرد تا آزردگی حیوانات به حداقل سطح ممکن برسد.
به طور خاص، نکات زیر در این پژوهش مدنظر قرار گرفتند:
شرایط آزمایشگاه حیوانات با توجه به استاندارد­های موجود تا حد امکان مد­نظر قرار گرفته شد.
همواره یک پژوهشگر با حیوانات در ارتباط بود تا استرس حیوانات به حداقل برسد.
برای ایجاد انگیزه در حیوانات برای انجام فعالیت­های ورزشی در دوره سازگاری از مواد خوراکی مورد علاقه آن­ها (مانند هویج) به عنوان تشویق پس از دویدن روی نوار­گردان استفاده شد. (لازم به ذکر است که به گروه کنترل نیز داده می­شد).
برای بیهوشی حیوانات قبل از نمونه گیری از دوزهای استاندارد استفاده شد و علاوه بر آن رفلکس­های مربوطه کنترل شد تا از بیهوشی کامل حیوان اطمینان حاصل شود.
حیوانات به طور انسانی (با حداقل درد و استرس) معدوم شدند.
۳-۶- شرایط نگهداری آزمودنی­ها
آزمایشگاه حیوانات دانشکده تربیت بدنی و علوم ورزشی دانشگاه خوارزمی با شرایط مطلوب برای حیوانات آماده شد. دمای محیط بین ۲۴ تا ۲۷ درجه سانتی ­گراد و میزان رطوبت ۵۵ تا ۶۰ درصد کنترل شد. برای تهویه از سیستم تهویه مطبوع و تصفیه هوا استفاده گردید. برای تنظیم چرخه روشنایی-تاریکی از تایمر خودکار استفاده شد. قبل از ورود حیوانات، آزمایشگاه حیوانات بصورت کامل نظافت و محل زندگی موش­های صحرایی با ساولن (بهسیمید-سی^[۵۱]) و دتول ضدعفونی می­شدند.
با توجه به سازگاری زیاد حیوانات آزمایشگاهی به شرایطی که در آن زندگی می­ کنند، تغییر این شرایط برای آن­ها استرس ­زا است(۷۸). لذا، برای انتقال این حیوانات از قفس­های مخصوص انتقال استفاده شد. پس از انتقال، برای سازگاری با شرایط جدید آزمودنی­ها برای مدت یک هفته بدون هیچ مداخله­ای در آزمایشگاه حیوانات قرار گرفتند. حیوانات بصورت چهار­تایی در قفس­های تیپ ۳ مخصوص جوندگان نگهداری شدند. برای رعایت نظافت قفس حیوانات از پوشال استریل که از موسسه تحقیقات واکسن و سرم­سازی رازی تهیه شده بود استفاده می­شد. پوشال قفس­ها هر روز تعویض می­شد و خود قفس­ها ۲ بار در هفته کاملا با مایع ضدعفونی­کننده شست­و­شو داده می­شد. تا جای ممکن این فرایند در زمان فعالیت ورزشی حیوانات انجام شد تا کمترین استرس به حیوانات وارد شود.
برای سازگاری کامل حیوانات، حیوانات به مدت دو هفته بدون هیچ گونه فعالیت تمرینی در آزمایشگاه حیوانات نگهداری شدند. در طی این دو هفته آشنا­سازی حیوانات با محیط صورت گرفت. همچنین حیوانات در قفس­ با کارت شناسایی مخصوص به خود قرار گرفتند.
۳-۷- خوراک حیوانات
خوراک مصرفی موش­های صحرایی پلت^[۵۲] نام دارد که از طریق موسسه تحقیقات واکسن و سرم­سازی رازی تهیه شد. موش­های صحرایی معمولا، روزانه به ازای هر ۱۰۰ گرم وزن بدن، ۱۰ گرم پلت نیاز دارند. همچنین روزانه ۱۰ تا ۱۵ میلی­لیتر آب به ازای هر ۱۰۰ گرم وزن بدن نیاز دارند(۷۸). در این پژوهش آب و خوراک به صورت آزاد در اختیار آن­ها قرار گرفت.
شکل ۳-۱- محل زندگی موش­های صحرایی در قفس
۳-۸- آشناسازی با نوار گردان
برای آشنا­سازی حیوانات با نوار­گردان، برای هر گروه تمرینی این امر به طور جداگانه در طی یک هفته طبق پروتکل زیر انجام گرفت:
گروه تمرین تناوبی سرعتی(۲۳):